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    本發明之課題為提供以溫和且簡便的方法、以高產率且高純度調製環狀磷脂酸鈉之方法。其解決手段為一種環狀磷脂酸鈉之製造方法，其係包含在於含有有機溶劑及/或水之系統中使磷脂酶D與溶血型磷脂質(惟氫化物除外)作用而得之反應物中添加鈉鹽後，由反應物去除溶劑。
    公开号:TW201313904A
    申请号:TW101120297
    申请日:2012-06-06
    公开日:2013-04-01
    发明作者:Kimiko Murofushi；Shigeyuki Imamura
    申请人:Sansho Co；
    IPC主号:C07F9-00
    专利说明:
    環狀磷脂酸鈉之製造方法及組成物
    本發明係關於環狀磷脂酸鈉之製造方法、以及含有藉由上述製造方法而得到之環狀磷脂酸鈉之組成物。
    環狀磷脂酸(以下亦有略稱為cPA)，已知具有阻礙癌細胞之轉移及浸潤等之生理活性(非專利文獻1)，而期待作為含有抗腫瘤劑之醫藥品或機能性食品的用途，又，由於具有生體內玻尿酸合成促進作用，係添加於化粧品。
    以往，作為如此之環狀磷脂酸的製造方法，已知有化學合成的方法(專利文獻1及2)、或利用使磷脂酶D與溶血型(lyso-form)磷脂質作用的酵素反應之方法(專利文獻3及4)。環狀磷脂酸係脂質而不溶於水，因此需要成為鈉鹽等水溶性之鹽，藉由將經化學合成之環狀磷脂酸，以氫化鈉或氫氧化鈉等強鹼處理，而轉換為鈉鹽的方法來調製環狀磷脂酸鈉。 [先前技術文獻] [專利文獻]
    [專利文獻1]日本特開平6-228169號公報
    [專利文獻2]日本特開平7-258278號公報
    [專利文獻3]日本特開2001-178489號公報
    [專利文獻4]日本特開2008-222643號公報 [非專利文獻]
    [非專利文獻1] Biochemica et Biophysica Acta 15288 (2002), p. 1-7
    因為環狀磷脂酸不安定，故使用如上述科學合成法所記載之強鹼的方法係不佳，又，化學合成法中難以以高產率及高純度得到環狀磷脂酸，期望以溫和且簡便的方法，以高產率且高純度調製環狀磷脂酸鈉的方法。
    本發明者等人，對環狀磷脂酸鈉之調製方法進行努力探討的結果，發現了藉由在於含有有機溶劑及/或水之系統中使磷脂酶D與溶血型磷脂質(惟氫化物除外)作用而得的反應物中添加氯化鈉後，由反應物去除溶劑，能夠於極溫和之條件下，以簡便的方法、高產率且高純度地調製環狀磷脂酸鈉。本發明係基於該見解而為者。
    亦即，依據本發明，提供以下之發明。
    (1)一種環狀磷脂酸鈉之製造方法，其係包含在於含有有機溶劑及/或水之系統中使磷脂酶D與溶血型磷脂質(惟氫化物除外)作用而得之反應物中添加鈉鹽後，由反應物去除溶劑。
    (2)如(1)記載之環狀磷脂酸鈉之製造方法，其中鈉鹽為氯化鈉。
    (3)如(1)或(2)記載之環狀磷脂酸鈉之製造方法，其中在於含有有機溶劑及/或水之系統中使磷脂酶D與溶血型磷脂質作用而得之反應物中，於螯合劑存在下添加鈉鹽。
    (4)如(3)記載之環狀磷脂酸鈉之製造方法，其中螯合劑為EDTA。
    (5)如(1)至(4)中任一項記載之環狀磷脂酸鈉之製造方法，其中溶血型磷脂質係使磷脂酶A2與來自大豆之磷脂質或來自蛋黃之磷脂質或來自玉米之磷脂質作用而得之溶血型磷脂質。
    (6)如(1)至(5)中任一項記載之環狀磷脂酸鈉之製造方法，其中溶血型磷脂質，係由使磷脂酶A2與來自大豆之磷脂質或來自蛋黃之磷脂質或來自玉米之磷脂質作用而得之反應物，不經單離精製溶血型磷脂質，而溶解於含有有機溶劑及/或水之系統，使磷脂酶D作用。
    (7)一種具有40%以上之純度的含有環狀磷脂酸鈉之組成物，其係藉由如(1)至(6)中任1項記載之環狀磷脂酸鈉之製造方法而得到。
    (8)一種含有1mg/mL以上之環狀磷脂酸鈉的溶液，其係藉由如(1)至(6)中任1項記載之環狀磷脂酸鈉之製造方法而得到。
    (9)如(8)記載之溶液，其中含有環狀磷脂酸鈉之溶液為水溶液。
    依照本發明，藉由於含有有機溶劑及/或水之系統中使磷脂酶D與溶血型磷脂質作用，能夠以極溫和且簡便的方法，以高產率且高純度來製造環狀磷脂酸鈉。依照本發明，只要將反應物以鈉鹽處理，可不經將環狀磷脂酸單離、精製，而調製環狀磷脂酸鈉，因此特別有用於作為以大豆等之天然物作為原料之環狀磷脂酸鈉的製造法。藉由本發明之製造條件所得之環狀磷脂酸鈉，特別是當以來自大豆之磷脂質或來自蛋黃之磷脂質或來自玉米之磷脂質作為原料時，於室溫之水溶性高、能夠不特別經精製而調製水溶液。
    以下，進一步詳細地說明本發明。
    本發明之特徵為，在於含有有機溶劑及/或水之系統中使磷脂酶D與溶血型磷脂質(惟氫化物除外)作用而得之反應物中添加氯化鈉後，由反應物去除溶劑。
    關於環狀磷脂酸鈉之調製，雖揭示有將來自氫化大豆之溶血磷脂醯膽鹼溶解於水，添加乙酸鈉緩衝液及2M氯化鈉，與磷脂酶D反應後，以氫氧化鈉水溶液中和，以氯仿/甲醇萃取，回收有機溶劑層，餾除溶劑，而得到環狀磷脂酸鈉(專利文獻4)，但僅揭示了所得之物質的脂肪酸組成，並無鈉含量等之記載，未明確地揭示其係環狀磷脂酸鈉。
    本發明者等人發現了磷脂酶D之酵素反應，即使不存在鈣離子亦會充分地進行，氯化鈉會阻礙酵素反應。進一步地，將溶血型磷脂質溶解於含有有機溶劑及/或水之系統，添加乙酸緩衝液，將pH調整為5.5~6.5，進行磷脂酶D之酵素反應，藉以使反應效率良好地進行，並且反應結束後藉由添加鈉鹽之水溶液，成功地產率良好地製造了環狀磷脂酸鈉。又，以來自大豆之磷脂質或來自蛋黃之磷脂質或來自玉米之磷脂質作為原料，不經單離精製使磷脂酶A2作用而得之溶血型磷脂質，而連續地進行磷脂酶D之反應時，反應液中會殘存少量的鈣離子，而精製出環狀磷脂酸之鈣鹽，但反應結束後藉由合併使用鈉離子與螯合劑，可得到高純度之環狀磷脂酸鈉。
    本發明中所用的鈉鹽，雖可使用氯化鈉、硫酸鈉、乙酸鈉、硝酸鈉等，但較佳為氯化鈉、硫酸鈉；更佳為氯化鈉。較佳可使用之氯化鈉濃度為0.5M~3M、更佳為2~3M。
    本發明中所用之螯合劑，為乙二胺四乙酸鈉(EDTA)、二乙三胺五乙酸、二醇醚二胺四乙酸、檸檬酸、酒石酸、植酸等，但較佳為乙二胺四乙酸鈉(EDTA)、二乙三胺五乙酸、二醇醚二胺四乙酸；最佳為EDTA。
    本發明中所用之有機溶劑，可使用氯仿、二氯甲烷、甲苯、乙醚、乙酸乙酯、己烷等，但較佳為氯仿、二氯甲烷、甲苯；更佳為氯仿、甲苯。
    本發明中所用之溶血型磷脂質，考慮磷脂酶D之基質特異性時，較佳為溶血磷脂醯膽鹼(LPC)，最佳為以來自大豆之磷脂質或來自蛋黃之磷脂質或來自玉米之磷脂質為原料，使磷脂酶A2作用而得之LPC。本發明中所用之溶血型磷脂質，氫化溶血型磷脂質係除外，而使用未氫化之溶血型磷脂質。
    本發明中所用之磷脂酶D，只要係當使上述溶血型磷脂質作用時，會生成cPA者，即無特殊限定，但特佳為使用來自Streptomyces sp.或Actinomadula sp.之磷脂酶D。
    溶血型磷脂質與磷脂酶D之反應，只要係能夠使酵素展現活性的條件，即無特殊限定，但較佳為使溶血型磷脂質溶解於氯仿等有機溶劑，添加乙酸緩衝液將pH由5.0調整為7.0，添加10~100單位/ml之磷脂酶D，加溫至25℃~50℃，一邊連續地攪拌，一邊反應5~30小時左右來進行。反應結束後添加2~3M之氯化鈉、0.1至0.3M之EDTA，連續地攪拌。將反應物離心分離(3000轉、5分鐘)回收有機溶劑層，餾除溶劑，可得到環狀磷脂酸鈉之粉末固體。反應結束後，亦可依需要添加甲醇等有機溶劑，回收有機溶劑層。欲得到更高純度之環狀磷脂酸鈉時，只要使用二氧化矽凝膠或吸附樹脂等來精製即可。
    依照本發明，係提供藉由上述本發明之環狀磷脂酸鈉之製造方法所得之具有40%以上純度之含有環狀磷脂酸鈉之組成物。純度較佳為45%以上、更佳為50%以上。本發明中所言的純度，係以標準品(97%純度品)做為控制組，藉由密度計來測定薄層層析法之點(spot)，且以面積比定量之結果所得的純度。標準品(97%純度品)，係藉由將實施例3中所得之高純度環狀磷脂酸鈉再層析以精製者，係具有實施例5所記載之脂肪酸組成者。
    進一步地，依照本發明，係提供藉由上述本發明之環狀磷脂酸鈉之製造方法所得之含有1mg/mL以上之環狀磷脂酸鈉的溶液。環狀磷脂酸鈉之濃度只要係1mg/mL以上即無特殊限定，可為2mg/mL以上、3mg/mL以上、或5mg/mL以上。
    由以下實施例說明本發明，但本發明不受該等實施例之任何限定。 [實施例] 實施例1；環狀磷脂酸鈉鹽之製造方法
    將大豆磷脂質(卵磷脂含量：70%)(未氫化物)10g以含有0.3M氯化鈣之100mL的1M乙酸緩衝液(pH6.5)溶解後，添加6000單位之來自Streptomyces屬的磷脂酶A2，於40℃攪拌18小時使其反應。將反應液調整至pH2.5使酵素失活後，添加100mL之氯仿、50mL之甲醇，充分攪拌混合，萃取脂質成分。收集氯仿層，以旋轉蒸發器減壓乾燥固化。於固體成分中添加100mL之丙酮，使磷脂質沈澱，去除游離脂肪酸。將沈澱物5g溶解於40mL之氯仿，添加1M乙酸緩衝液(pH5.5)10mL，進一步添加1500單位之來自Actinomadula屬之磷脂酶D，於40℃攪拌18小時同時進行反應。於反應液中添加20mL之3M氯化鈉、20mL之0.1M EDTA溶液，於40℃進行攪拌1小時。進一步添加20mL之甲醇，充分攪拌後，離心分離3000轉、5分鐘，收集氯仿層。將此溶液以旋轉蒸發器減壓乾燥固化，得到環狀磷脂酸鈉鹽3.8g。因為由卵磷脂含量70%(10g中7g)中得到環狀磷脂酸Na 3.8g，故產率為54.3%。環狀磷脂酸鈉鹽之純度分析，係使用二氧化矽凝膠片，以氯仿：甲醇：乙酸：5%二亞硫酸鈉(100：40：12：5、V/V)展開後，於5%乙酸銅：8%磷酸：2%硫酸混合液中短時間浸漬，風乾後，於180℃加熱約10分鐘後，對生成之點進行掃描器(Atto公司製)法。亦即，以標準品(97%純度品)做為控制組，藉由密度計測定薄層層析法之點，以面積比定量。上述步驟中得到之生成物中環狀磷脂酸鈉鹽的純度為54%。 實施例2；不使用螯合劑之環狀磷脂酸鈉鹽之製造方法
    將大豆磷脂質(卵磷脂含量：70%)(未氫化物)10g以含有0.3M氯化鈣之100mL的1M乙酸緩衝液(pH6.5)溶解後，添加6000單位之來自Streptomyces屬之磷脂酶A2，於40℃攪拌18小時使其反應。將反應液調整至pH2.5使酵素失活後，添加100mL之氯仿、50mL之甲醇，充分攪拌混合，萃取脂質成分。收集氯仿層，以旋轉蒸發器減壓乾燥固化。於固體成分中添加100mL之丙酮，使磷脂質沈澱，去除游離脂肪酸。將沈澱物5g溶解於40mL之氯仿，添加1M乙酸緩衝液(pH5.5)10mL，進一步添加1500單位之來自Actinomadula屬之磷脂酶D，於40℃攪拌18小時同時進行反應。於反應液中添加20mL之3M氯化鈉，於40℃進行攪拌1小時。進一步添加20mL之甲醇，充分攪拌後，離心分離3000轉、5分鐘，收集氯仿層。將此溶液以旋轉蒸發器減壓乾燥固化，得到環狀磷脂酸鈉鹽3.7g。因為由卵磷脂含量70%(10g中7g)中得到環狀磷脂酸Na3.7g，故產率為52.9%。環狀磷脂酸鈉鹽之純度分析，係以實施例1記載之方法進行。本步驟中所得到之生成物中環狀磷脂酸鈉鹽之純度為53%。 實施例3；高純度環狀磷脂酸鈉鹽之製造方法
    將實施例1中得到之環狀磷脂酸鈉鹽500mg溶解於5mL之含有10%甲醇之氯仿，載入二氧化矽凝膠管柱，以同一溶劑展開，進一步地以含有20%甲醇之氯仿展開，分取10mL之分離部分(fraction)。藉由實施例1所示之TLC法，確認含有環狀磷脂酸鈉鹽之分離部分且收集之，以旋轉蒸發器減壓乾燥固化，得到環狀磷脂酸鈉鹽之粉末320mg。本試樣之環狀磷脂酸鈉鹽的純度為95%。 實施例4；離子層析法之鈉含量的分析
    對實施例1及實施例2中得到之環狀磷脂酸鈉鹽，藉由離子層析法測定鈉含量。管柱係使用IonPac CS14(日本Dionex公司製)、移動相使用10mM甲烷磺酸水溶液、流速1.0mL/分鐘、管柱溫度為30℃、注入量為10μL、檢測係以電導檢測器進行。標準溶液係使用陽離子混合標準液II(Li+ 0.5mg/L，Na+ 2mg/L，NH4 + 2mg/L，K+ 5mg/L，Ca2+ 5mg/L，Mg2+ 5mg/L)。管柱溫度為30℃、注入量為10μL。分析的結果，由檢測出與環狀磷脂酸等莫耳的鈉，可知為1鈉鹽。 實施例5；
    藉由氣相層析法來分析實施例3中所得之高純度環狀磷脂酸鈉之脂肪酸組成。溶解於鹽酸甲醇使試樣成為20mg/mL，於65℃加溫30分鐘。回到室溫後，添加等量的水、接著添加等量的己烷，充分攪拌混合。進行離心分離3000轉、5分鐘，將己烷層2μL注入毛細管柱，分析構成脂肪酸。分析係如以下所示。
    實施例6；環狀磷脂酸鈉水溶液之狀態
    調製實施例1及實施例2中所得之環狀磷脂酸鈉之1mg/mL水溶液，測定於660nm之吸光度。實施例1所得之試樣的吸光度為0.05、實施例2所得之試樣的吸光度為0.15。實施例1所得之試樣，係以使用了螯合劑之製造方法所得之試樣，故鈣鹽不存在而成為透明。 比較例1；環狀磷脂酸鈉水溶液之狀態
    使用氫化大豆磷脂質以取代實施例1記載之大豆磷脂質，藉由與實施例1之記載同樣的操作，得到環狀磷脂酸鈉。調製此環狀磷脂酸鈉之1mg/mL水溶液，測定於660nm之吸光度。吸光度為0.33。 實施例7：環狀磷脂酸鈉鹽之製造方法
    將大豆磷脂質(卵磷脂含量：70%)(未氫化物)10g以含有0.3M氯化鈣之100mL的1M乙酸緩衝液(pH6.5)溶解後，添加6000單位之來自Streptomyces屬之磷脂酶A2，於40℃攪拌18小時使其反應。將反應液調整至pH2.5使酵素失活後，將pH調整至5.5。接著於此反應液中添加1500單位之來自Actinomadula屬之磷脂酶D，於40℃攪拌18小時同時進行反應。於此反應液中添加己烷100mL，於室溫進行30分鐘攪拌萃取。藉由離心分離收集己烷層，於其中添加由10mM之EDTA、0.1M乙酸緩衝液pH6.5、0.5M氯化鈉所構成之水溶液50mL，於室溫攪拌30分鐘後，藉由離心分離收集己烷層，以旋轉蒸發器濃縮。於其中添加丙酮50mL，充分攪拌、離心分離藉以去除丙酮層。重複此操作2次，去除游離脂肪酸。收集丙酮不溶物，減壓乾燥，得到環狀磷脂酸鈉3.6g。
    权利要求:
    Claims (9)
    [1] 一種環狀磷脂酸鈉之製造方法，其係包含在於含有有機溶劑及/或水之系統中使磷脂酶D與溶血型磷脂質(惟氫化物除外)作用而得之反應物中添加鈉鹽後，由反應物去除溶劑。
    [2] 如申請專利範圍第1項之環狀磷脂酸鈉之製造方法，其中鈉鹽為氯化鈉。
    [3] 如申請專利範圍第1或2項之環狀磷脂酸鈉之製造方法，其中在於含有有機溶劑及/或水之系統中使磷脂酶D與溶血型磷脂質作用而得之反應物中，於螯合劑存在下添加鈉鹽。
    [4] 如申請專利範圍第3項之環狀磷脂酸鈉之製造方法，其中螯合劑為EDTA。
    [5] 如申請專利範圍第1至4項中任一項之環狀磷脂酸鈉之製造方法，其中溶血型磷脂質係使磷脂酶A2與來自大豆之磷脂質、來自蛋黃之磷脂質或來自玉米之磷脂質作用而得之溶血型磷脂質。
    [6] 如申請專利範圍第1至5項中任一項之環狀磷脂酸鈉之製造方法，其中溶血型磷脂質，係由使磷脂酶A2與來自大豆之磷脂質、來自蛋黃之磷脂質或來自玉米之磷脂質作用而得之反應物，不經單離精製溶血型磷脂質，而溶解於含有有機溶劑及/或水之系統，使磷脂酶D作用。
    [7] 一種具有40%以上之純度的含有環狀磷脂酸鈉之組成物，其係藉由如申請專利範圍第1至6項中任一項之環狀磷脂酸鈉之製造方法而得到。
    [8] 一種含有1mg/mL以上之環狀磷脂酸鈉的溶液，其係藉由如申請專利範圍第1至6項中任一項之環狀磷脂酸鈉之製造方法而得到。
    [9] 如申請專利範圍第8項之溶液，其中含有環狀磷脂酸鈉之溶液為水溶液。
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    法律状态:
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    JP2011126901||2011-06-07||
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